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    次氯酸水消毒殺菌劑

    作者:愛環吳世 日期:2021-11-05 瀏覽:1647

    蛋白質是構建生命體的基本物質之一,在合成、催化和信號傳感等所有生命活動中均承擔著重要的功能。開發一種可靠、高效的蛋白質測序技術對于理解生命過程和揭示疾病機理而言至關重要。作為構成蛋白質的組成片段,多肽,成為打開蛋白質這扇大門的“鑰匙”。

    納米孔測序技術是近年來新興的一種單分子測序技術,其中多肽納米孔測序仍面臨諸多挑戰。近日,南京大學化學化工學院研究團隊在國際知名期刊《納米快報》雜志發表論文,他們利用納米孔錯位測序技術,像在水井里提繩打水一樣,構建了多肽-DNA嵌合鏈,用DNA測序酶與DNA的結合,通過DNA的移動,帶動多肽分子在納米孔內的棘輪運動,從而實現了多肽的納米孔測序,破解了技術瓶頸。

    無法進行序列擴增,制約蛋白質測序靈敏度

    蛋白質,組成人體一切細胞、組織的重要物質,可以說,沒有蛋白質就沒有生命。而蛋白質的功能是由蛋白質的序列決定的,序列的微小改變,可能導致蛋白質失去生物活性或者誘發疾病。

    如果能為蛋白質測序,就可以確定蛋白質是否有序列變化,判斷是否會對人類健康有影響。

    “與核酸檢測不同,目前蛋白質測序的難點在于,缺乏有效的序列擴增方法,技術發展上停滯不前,主要靠質譜法和埃德曼降解法來測序?!痹撈撐牡耐ㄓ嵶髡?、南京大學化學化工學院教授黃碩說。

    通俗地說,質譜法是用生物酶將蛋白質分解成很多多肽片段,再通過質譜儀器檢測,確定蛋白質片段的信息,最終將這些片段重構成蛋白質序列。而埃德曼降解法是用化學方法將蛋白質N端的一個氨基酸切下來進行鑒定,再進行第二輪的氨基酸切割和鑒定,多次循環操作后,確定氨基酸的序列。

    但在黃碩看來,這兩個方法都有局限性?!跋噍^于DNA和RNA測序,構成蛋白質的氨基酸種類更多,質譜法的檢測難度大于核酸測序。而對埃德曼降解法來說,它只能對單一的蛋白質樣品序列解析,如果降解的樣品純度不夠,混合有多種蛋白質樣品,那么被切下來的氨基酸就會有很多種,就無法確定哪個氨基酸來自哪個蛋白質的,無法判斷蛋白質的序列。另外,還有一些肽段的末端是封閉的,就不能用降解法?!秉S碩介紹。

    更重要的是,由于無法實現序列擴增,蛋白質測序的靈敏度度較低,這意味著無法檢測自然界中一些豐度很低的蛋白質樣品。黃碩認為,利用現有的技術,復雜環境中的蛋白質,難以直接測序,比如體液、土壤、水體中的蛋白質樣品,要先做一些純化、富集,達到測序的樣品標準,才能在質譜儀中測序。同時,蛋白質的化學修飾很豐富,這也有可能干擾蛋白質測序。

    借助DNA與酶的反應,牽引肽鏈在納米孔中可控運動完成測序

    能不能找到一種更微觀的測序方式,只用一個分子就能為蛋白質測序?從2015年開始,納米孔測序技術進入黃碩課題組研究視野。

    納米孔測序技術是近年來新興的一種單分子測序技術,已在DNA和RNA測序方面取得成功,它通過讓單鏈的核酸通過納米孔,通過納米孔內的檢測器獲得核酸鏈的堿基信息。

    “如果能在單分子水平上為蛋白質測序,將為檢測低豐度蛋白和單細胞蛋白質組學提供極高的靈敏度?!笔艽藛l,黃碩課題組開始研究,用納米孔測序技術,進行蛋白質或多肽的單分子測序。

    但是多肽納米孔測序仍面臨諸多挑戰,其中一個主要的困難是如何實現多肽在納米孔中可控的棘輪運動,而這主要受限于目前沒有和肽鏈相匹配、有很強的親和力的多肽測序酶。

    “棘輪運動指的生物高分子貼著納米孔的內壁,順著同一個方向做勻速、定向運動,類似于附著在齒輪內壁上移動一樣,這需要找到一種酶來控制多肽的運動速度,從而控制它穿過納米孔的速度,以精準測序?!?/p>

    此前,黃碩課題組曾嘗試對非天然核酸測序,但是苦于沒有找到合適的酶來匹配棘輪運動,后來,他們突發奇想,利用納米孔的錯位效應來測序,并開創了納米孔錯位測序技術。

    “核酸的納米孔識別位點和酶的反應位點,有一個固定的約14-15個堿基的錯位,這就形成了一個測序窗口,可以利用這個不受酶反應限制的窗口,實現多肽的測序?!秉S碩說。

    納米孔錯位測序技術能否應用在多肽測序領域?近期,黃碩課題組在技術驗證時發現可行。在此次研究中,他們將多肽和DNA嵌合成一條鏈條,嵌合鏈的DNA部分為“牽引鏈”,在檢測過程中,DNA測序酶與DNA結合,通過拉動DNA部分,牽動整條鏈條在納米孔中的可控棘輪運動,實現多肽的納米孔直接讀取。

    黃碩打了個比方,“這就相當于用繩子在井里提水桶,如果井是納米孔的話,井繩就是DNA,水桶就是多肽?!凇腄NA測序酶拉動DNA在納米孔內移動,而DNA又與多肽嵌合在一起,DNA的移動,也就直接拉動了多肽的移動,從而實現了多肽的納米孔測序?!?/p>

    黃碩介紹,經驗證,多肽的納米孔測序信號表現出高度的一致性和序列相關性,由單氨基酸替換引起的電流變化也能被清楚地檢測到。通過將多肽的N端或C端與DNA驅動鏈進行偶聯,實現了對多肽兩端氨基酸序列信息的讀取。

    “這意味著,可以對蛋白質單分子進行測序,這為今后的蛋白質高通量測序,蛋白質重構,提供了一個全新的工具?!秉S碩說,借助蛋白質序列研究,可以對蛋白質的功能進行預測,從而幫助理解、解釋相關生命活動。

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